抗氧化劑的測定
人工合成的抗氧化劑有 ：
（1） BHT 2，6-二叔丁基對甲酚
�。�2） BHA 叔丁基對羥基茴醚
�。�3）PG 沒食子酸丙酯
近幾年也合成了一些新的抗氧化劑如TBHQ, DBHA等還有一些新的天然抗氧化劑，但投入使用的不多。
�、攀宥』鶎αu基茴香醚結構
特點：
1）對熱穩定
2）在弱堿性中不破壞（作為焙烤食品用的抗氧化劑）
這種抗氧化劑在日本是禁止的
�、� 2，6-二叔丁基對甲酚結構
特點：（1）抗氧化性強于BHA；（2）毒性大于BHA
這種抗氧化劑在美國是禁止使用的
�、菦]食子酸丙酯結構
特點 ：（1）耐熱性強；（2）溶于油脂，酒精等有機溶劑中
以上三種人工合成抗氧化劑我國都在使用，抗氧化性最強是混合使用，二種抗氧化劑混合使用效果最好，但要加增效劑，常用的增效劑有檸檬酸，抗敗血酸，磷酸等可以提高抗氧化劑的作用。而增效劑主要是絡合重金屬離子，使氧化性獲得新生。
我們從以上三種氧化劑結構中可以看出，它們都有苯酚，所以我們要找抗氧化劑必須找酚類衍生物，我們要了解抗氧化劑的機理，它們怎樣阻止氧化�？寡趸瘎┑目寡趸瘷C理。
油脂氧化機制 （1）鏈引發；（2）鏈傳播；（3）終止
從RH代替脂肪或者脂肪酸
第一步： RH→R*.+H*
第二步：脂肪RH受熱或光金屬
第三步：R*+O2→ROO* RO2*+RH→ROOH+R*
第四步 R*+ R*→R-R R*+ RO2*→RO2R
第二步脂肪RH受熱或光金屬催化劑等分解成不穩定的游離基R和H, 游離基當與空氣中的O2時生成過氧化物游離基過氧化物，游離基在于脂肪RH生成氫過氧化物和游離基R，產生的游離基與游離基相互結合，使反應終止，隨著反應的進行，更多脂肪分子轉變成氫過氧化物，氫過氧化物進一步變化，產生更多的游離基和穩定的終產物，這些就導致了油脂完全的變質的酸敗味的形成和種種的反應生成。
抗氧劑的機制（以AH代表抗氧劑）
AH+ R*→RH+A*
抗氧化劑的作用機制是遇到游離基后將游離基破壞，也就是說反映關鍵是把R*，RO2*作用掉，
這樣就終止了鏈傳播，延長了酸敗。
A*+ A*→A－A
A*+ RO2*→ROOA
抗氧化劑--阻止，延遲脂肪自動氧化作用的物質稱為抗氧化劑。
抗氧化劑的使用劑量為 �。�.０２％ 即萬分之二
增效機劑為抗氧化所加的１/４---１/２即０.０１％
抗氧化劑是油溶性的，所以能引起油脂酸敗，植物油比豬油保存的時間長因為植物油或多或少的含有一些抗氧化物質比如生育酚等，而豬油不含有抗氧化劑所以易腐敗。
一. BHA測定（比色法）
1.原理 用石油醚將樣品中的BHA提取出來，根據BHA在石油醚和含水乙醇項中分配系數不同，使其溶解72%的乙醇中，BHA與2，6-二氯醌氯亞胺的硼砂溶液生成一系列蘭色反應，可比色測定620nm.
2.操作方法
(1)繪標準曲線 編號 1 2 3 4 5 6
BHA標液10μg/ml 0. 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9
72%乙醇 ————→分別稀釋12ml←———————
0.01%2，6---二氯醌氯亞胺 2 2 2 2 2 2
硼砂溶液2% 2 2 2 2 2 2
靜止15分鐘
比色620nm 繪制標準曲線
(2)樣品分析
稱魚肉2g→于50ml量筒→加無水乙醇2 ml→石油醚（30-60℃ ） 48ml→搖勻→靜止24小時→吸上溶液25ml→于125ml分液漏斗中→用72%乙醇分四次提取→合并于50ml容量瓶→加72%乙醇于刻度，若渾濁過濾→取2ml于比色管中→加72%乙醇12ml→加2，6---二氯醌氯亞胺2ml→硼砂溶液2ml→靜止15分鐘→620nm比色
(3)計算 BHA(μg/kg)=V*V1*C/W*V2*V3
V--------樣品定容總體積(ml)
V1------------將提取液定容(ml)
C---------相當于標液濃度
W--------樣品的重量（g）
V2--------取樣品總體積(ml)
V3-----------測定時所用提取液的總體積
BHA(mg/kg)=C/W *100
C-------相當于BHA的標準量(mg)
W------相當于樣品溶液的重量(g)
注意事項：
染料2，6---二氯醌氯亞胺溶液見光后易變質，儲于棕色瓶中超過6小時經重新配制在冰箱中可保存3天，一般為用時配制。
例：腌魚肉2克定容50 ml取出25ml提取BHA定容50ml,測定時取2ml, 取溶液（相當于5微克）代入上式計算
BHA(mg/kg)=V/W * V1-/ V2 C/ V3=50ml/2g *50ml/25ml *5μg/2ml=125(mg/kg)
二 PG（沒食子酸丙酯）
沒食子酸丙酯（PG）也是常用的一種抗氧化劑，由于其合成工藝簡單，原料低廉，廣泛用于低檔產品中它是由沒食子酸和正丙醇酯化而成的白色或微褐色結晶性粉末，本身微苦，熔點145-148℃，有吸濕性，耐熱性強，溶于油脂，酒精等有機溶劑中。動物性油脂中抗氧化能力較強，遇鐵離子容易出現呈色反應。
1. 比色法原理：
PG與2，2，--聯吡啶---氯化鐵溶液生成橘紅色的發色團，所生成的顏色深淺與PG的含量成正比關系，在530 nm下比色。
2. 操作步驟
a.制標準曲線
取10ml比色管 1 2 3 4 5 6
PG(10μg/ml) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
無水乙醇(ml) 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
加水 ———→5.5ml——————
避光出加顯色劑 ————1ml ←————
暗處放1小時 ，530nm處比色
b.樣品的處理：稱樣5g→于燒瓶中→加石油醚50ml→振動30分鐘→取上清夜25 ml→于分液漏斗→用40 ml水提取三次→提取液合并于50 ml容量瓶→加水至刻度供測定
c.測定： 吸2 ml與比色管→加無水乙醇2.5ml→加水3.5 ml→搖勻→暗處加2，2，--聯吡啶---氯化鐵溶液1ml→三氯化鐵1ml→暗處放1小時→530nm比色，同時做空白
d.計算：PG(mg/kg)=V1/W *V3/V2 *C/V4 *1000/1000
C---相當于標準PG的濃度（μg/ml）
V1---樣品稀釋總體積（ml）
V2---取總體積進行提�。╩l）
V3---提取后定容(ml)
V4---比色時提取液體積（ml）
三 BHT的測定
為了提高油脂的穩定性，防止酸敗，延長保質期,近幾年來國內已開始在食用油中添加抗氧化劑，由于抗氧化劑BH、PG對熱穩定性較差，而BHT的熱穩定性較好，能適應精練油的全過程，所以在食用油中添加抗氧化劑BHT。
1.比色法原理
油脂中的抗氧化劑BHT經水蒸氣蒸餾法將BHT從油脂中分離出來，其蒸餾液將BHT從油脂中分離出來，其餾出物經冷凝后溶于甲醇中，遇鄰聯二茴香胺，亞硝酸鈉試劑，生成橙紅色物質，用氯仿萃取后的深紅色溶液在520nm處比色測E。
3. 標準曲線的繪制
取6個用黑布扎的60ml分液漏斗,分別吸BHT標準溶液5μg/ml 于60ml分液漏斗中→加50%甲醇溶液至25ml→ 加鄰聯二茴香胺溶液5ml→搖勻→加0。3%亞硝酸鈉2ml→搖1分鐘→放置10分鐘→加氯仿10ml→搖1分鐘→分層后→將下層氯仿放入黑紙包扎的10ml比色管→520nm測E→繪制標準曲線
3.樣品處理
將油脂樣5g→于500ml蒸餾瓶→加無水CaCL2 16克→水10ml→當溫度達到165℃→連接好水蒸氣裝置→用50ml甲醇的容量瓶接收（最好是200ml）→收集餾液為100ml(共計150 ml)→用熱甲醇（40-50℃）分次洗滌冷凝管→合并于容量瓶→用甲醇定容200ml
4. 測定
吸餾液25ml→于黑布包扎的60ml分液漏斗→加鄰聯二茴香胺溶液5ml→搖勻→加0.3%亞硝酸鈉
2ml→搖勻1分鐘→放10分鐘→加10ml氯仿→振搖1分鐘→分層后→將氯仿液放入黑紙包扎的10ml
比色管→520nm下測E
5. 計算
BHT(mg/kg)=V/W*C/V1
W----樣品重量(g)
V----樣品定容體積(ml)
V1------測定時所用的提取液體積（ml）
C-------相當于標準濃度(μg)
6. 注意事項：
(1) 控制蒸氣后不要太高，以免油滴帶出，影響測定結果
（2）蒸餾結束后，用熱的甲醇淋洗彎管以及冷凝管必須少量多次，以免沖洗不干凈，影響結果偏低。
�。�3）加入顯色劑后的反應時間以5—7分鐘顯色到達最高峰10分鐘之內保持恒定，然后逐漸褪色，所以必須靜置10分鐘，然后立即加氯仿萃取。
�。�4）氯仿萃取后，放于暗處1小時，如果暴露于光線中會很快褪色。
�。�5）所生成的有色物，對光具有敏感性，在暗處內操作最好
四 BHA和BHT混合使用時分離與測定方法，分別顯色比色法
1.原理
用石油醚提取食品中的BHA和BHT。通過硅膠柱使BHA和BHT分離，BHA與2,6---二氯醌氯亞胺-
硼砂溶液生成蘭色。BHT與2，2，---聯吡啶---氯化鐵溶液生成橘紅色發色團，與標準比色定量。
2..試劑
⑴ 0.01% 2，6---二氯亞胺乙醇液，采用無水乙醇配置存于棕色瓶中，冰箱保存可存三天。
�、婆鹕熬彌_溶液：取硼砂0.6g氯化鉀0.7g, NaOH 0.26g 加無水乙醇至500ml，過濾即可使用。
�、�0.2 % а,а’-聯吡啶溶液：稱取а，а’-聯吡啶0.2g置于燒杯中，加入2ml乙醇，定100ml。
�、�02.%FeCL3溶液：24 小時后重新配置。
�、�30%乙醇液
�、适兔� 30-60℃
�、斯枘z，柱層析用，不活化。
⑻BHA溶液 稱BHA 0.050g→加少量無水乙醇溶解后→轉移100ml棕色容量瓶用無水乙醇定容→避光保存→此液為0.5mg/ml臨用時取1ml于50ml容量瓶→加無水乙醇定容→為10微克/毫升的BHA
⑼BHT標液：稱BHT0.1000g→少量無水乙醇溶解后→定容100ml（用無水乙醇定容）→為1.0mg/ml→取1ml定容100ml（用無水乙醇定容）→為10微克/毫升
3.方法（整個過程要避免光照進行）
1)樣品處理
取磨碎樣10g→于帶塞三角瓶→加石油醚50ml→振搖20分鐘→靜止后取上層液25ml→通過硅膠柱用石油醚淋洗→收集150ml淋洗液→作為BHT檢驗液→取出5ml 于蒸發皿中自然揮干→用30%乙醇6ml洗滌濾紙→濾液于洗液合并于比色管→供BHT測定。 無水乙醇淋洗以石油醚淋洗后的硅膠柱，至淋洗液為100ml，供BHT測定。
2） 測定:
a)BHT 的測定：
標準曲線的繪制
取6個比色管編號 1 2 3 4 5 6
分別吸BHT標液 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
30%乙醇液 ———→1ml←—————————
加0.2%2，2-聯吡啶 ———→1ml←———————
暗室中加2，2-FeCl2 ———→1ml←———————
放置60分鐘進行比色（波長520nm），繪制標準曲線
樣品的測定：取上面BHT測定液20ml→于比色管→加30%乙醇至8ml→加0.2% 2，2---聯吡啶1ml→以下按標準曲線繪制
b)BHA的測定
標準曲線的繪制，取6個比色管編號，1 2 3 4 5 6
吸取BHA標液 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
加無水乙醇 ———→稀釋總體積8ml←—
加0.01%2，6-二氯醌氯亞胺 ———→1ml←—
硼砂緩沖溶液 ———→2ml←—————
靜止20分鐘于620nm測定消光值，繪制標準曲線
樣品的測定：取BHA測定液4ml→于比色管→用無水乙醇稀釋至8ml→以下同標準曲線的繪制
4.計算： BHT或BHA(μg/kg)=V/W*V2/V1*C/V3*1000/1000
C-----測定用樣液中BHA或BHT的含量(μg)
V-----BHA或BHT混合時的總體積（ml）
V1 ---BHA或BHT分離時的體積（ml）
V2----BHA或BHT分離后的定容體積（ml）
V3----BHA或BHT分離后的測定用量 （ml）
W-----樣品重量（g）
1000---將μg換算成 mg
1000----表示單位（將g換成Kg）
5.注意事項：
⑴抗氧化劑本身會被氧化，樣品隨著存放時間的延長含量會下降，所以樣品進入實驗室應盡快分
析，避免結果偏低。
⑵抗氧化劑BHT穩定性較差，易受陽光，熱的影響，操作時應避光。
�、怯弥鶎臃蛛x含油脂多的食品，會受到溫度的影響，室溫度低，流速緩慢，使分離效果受一些影響，最好溫度在20℃以上進行分離。
五 BHA、BHT、PG混合使用時的測定方法
目前國內的一些食品廠，近年來，有的將三種或其中的兩種，分別用
于高油脂的食品中如餅干、巧克力、奶糖、花生米、核桃仁罐
等BHA、BHT、PG混合使用時BHA與 BHT的總量不得超過0.1g/kg，
即100mg/kg, 而 PG不得超過50mg/kg。本法是用石油醚將食品中的三種抗氧化劑萃取出來，然后從萃取液中萃取PG，再經硅膠柱層析將BHA,BHT分離。
1.原理：抗氧化劑與福林---酚試劑結合，生成一種蘭色絡合物，所生成的顏色深淺與抗氧化劑的濃度成正比，可比色定量。
2.試劑：a.石油醚30-60℃;b.10%碳酸鈉; c.無水乙醇; d. 硅膠，柱層析用，60目; e.福林---酚試劑：稱鉬酸鈉25g→加入85%磷酸50ml，濃鹽酸100ml，水700ml，回流加熱10小時，然后加入硫酸鋰150g，水50ml，溴數滴，煮沸15分鐘，最后加水稀釋到1000ml,使用時用水稀釋三倍; f.抗氧化劑標液：稱PG、BHA、BHT各100微克，用80%乙醇溶液溶解后定容100ml(棕色瓶)→冰箱中保存即1000微克/毫升。
3.操作方法
1) BHT的提純方法：取一層層析柱，按規定裝填好，先用石油醚潤濕，將上面提純的PG后分液漏斗內剩余的石油醚層（BHT與BHA的混合液，）全部注入層析柱，用石油醚淋洗，收集150ml淋洗掖作為BHT檢查液;
2) BHT的提純方法：根據層析柱內淋洗液基本流盡，再用無水乙醇淋洗，收集100ml淋洗液，供BHA檢驗液。
3）顯色：吸取PG檢驗液5ml于10 ml比色管中，取BHT與BHA各5 ml分別于蒸發皿中，在暗室中自然風干，然后在PG、BHA、BHT被檢液中各加入10%碳酸鈉0.5ml混勻后，各加入0.5ml福林---酚試劑，用水稀釋到總體積6 ml放2小時后顯色，在730nm下測定E.。4)標準曲線的繪制
準確吸取不同濃度的抗氧化劑標液于10ml比色管中。
10ml比色管 1 2 3 4 5 6
標液10μg/ml 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
10%碳酸鈉 ———→0.5ml←——————
水 ———→4ml←——————
福林---酚試劑 ———→0.5ml←——————
加水 ———→至總體積6ml←——————
放兩小時比色（730nm測定PG、BHA、BHT的E）,繪制標準曲線。
4.計算：根據測的樣品的溶液的光密度，從標準曲線上分別查出對應的PG、BHA、BHT含量（微克/毫升）。
抗氧化劑（mg/Kg）= V/W*V2/V1*C/V3*1000/1000
C-----從標準曲線上查得的PG,BHA,BHT的濃度（微克/毫升）
V-----樣品定容得體積（ml）
V1 ---PG、BHA、BHT分離時的體積（ml）
V2---PG、BHA或BHT分離后的每種的定容體積（ml）
V3----顯色時取樣液得體積 （ml）
W-----樣品重量（g）
1000---將μg換算成 mg
1000----表示單位（將g換成Kg）
5.注意事項：
�、趴寡趸瘎〣HT穩定性較差、易受陽光、熱的影響，操作時應避光。
�、瓶寡趸瘎┍旧頃谎趸�，應盡快分析，避免誤差。
�、菍游鲋拇笮�，吸附顆粒的范圍，吸附劑的多少，裝填的高度都對分離有影響，必須嚴格控制條件。中國糧油儀器在線 http://www.radiant-cloud.com
